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稳定同位素标记 细胞分裂素

更新时间:2024-08-15

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厂商性质:其他

生产地址:美国

简要描述:
稳定同位素标记 细胞分裂素--赛可锐--现货--植物激素内标
[15N4]meta-TOPOLIN RIBOSIDE (15N-mTR) [6-(3-hydroxybenzylamino)-9-b-D-ribofuranosyl[15N4]purine]2271138-17-9
品牌SCRSTANDARDCAS2271138-17-9
供货周期现货主要用途科研用
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,制药,综合

细胞分裂素 (cytokinin,CTK)从玉米或其他植物中分离或人工合成的植物激素。一般在植物根部产生,是一类促进胞质分裂的物质,促进多种组织的分化和生长。与植物生长素协同作用。是调节植物细胞生长和发育的植物激素。在细胞分裂中起活化作用,也包含在细胞生长和分化及其他相关的生理活动过程中,如激动素(KT)、玉米素(ZT)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)等。

细胞分裂素是一类促进细胞分裂、诱导芽的形成并促进其生长的植物激素。曾译为细胞激动素。cytokinin一词源于cytokinesis(细胞分裂)。主要分布于进行细胞分裂的部位,如茎尖、根尖、未成熟的种子、萌发的种子、生长着的果实内部。
刚发现时亦称细胞激动素"。是一类植物激素。1955年美国斯库格(Skoog)等在研究植物组织培养时,发现了一种促进细胞分裂的物质,被命名为激动素。它的化学名称为6-糠基氨基嘌呤(KT),纯品为白色固体,能溶于强酸、碱中。激动素在植物体中并不存在。之后在植物中分离出了十几种具有激动素生理活性的物质。现把凡具有激动素相同生理活性的物质,不管是天然的还是人工合成的,现已有人工合成的植物生长调节剂统称为细胞分裂素。
它们的基本结构是有一个6-氨基嘌呤环。植物体内天然的细胞分裂素有玉米素(ZT)、二氢玉米素、异戊烯腺嘌呤、玉米素核苷、异戊烯腺苷等。它们在体内合成的部位主要是根尖。人工合成的细胞分裂素除了激动素外,还有6-苄基氨基嘌呤(6-BA)等。
细胞分裂素明显的生理作用有两种:一是促进细胞分裂和调控其分化。在组织培养中,细胞分裂素和生长素的比例影响着植物器官分化,通常比例高时,有利于芽的分化;比例低时,有利于根的分化。二是延缓蛋白质和叶绿素的降解,延迟衰老。
各种细胞分裂素的活性有差异,例如在促进生长的生物试验中,天然的细胞分裂素如玉米素、异戊烯腺嘌呤,比人工合成的细胞分裂素如6-苄基氨基嘌呤激动素高,而在延缓叶绿素分解的生物试验中,后者活性比前者高。

细胞分裂素与植物的细胞分裂

细胞分裂素与植物的细胞分裂密切有关,研究发现在拟南芥的主根中,细胞分裂素并不直接影响根分生组织区中的细胞分裂,而是主要通过控制拟南芥主根分生组织区的细胞分化速度,来影响分生组织区的大小。外源添加细胞分裂素,可以在不影响细胞分裂的情况下使主根的分生组织区变小;而部分参与细胞分裂素合成或信号转导途径的基因的缺失突变体,则表现出分生组织区增大的现象。对于这些基因的表达形态分析和用组织特异方法降低细胞分裂素的实验表明,细胞分裂素特异地作用于基部分生组织区的维管线织,通过影响一个由AHK3/ARR1、AHK3/ARR12组成的细胞分裂素信号通路,来控制所有其他组织中细胞的分化速度在拟南芥主根中,细胞分裂和细胞分化的平衡主要是由 SHORT HYOPCOTYL2(SHY2)基因通过联结并调控生长素和细胞分裂素信号通路来实现的。生长素通过诱导SHY蛋白的降解,来解除SHY2对于许多受生长素调节的基因的转录抑制,而SHY2蛋白的稳定性在shy2功能获得型突变体中的增加,则可以抑制PIN基因的表达,并导致主根的分生组织区变小,表明生长素通过控制SHY2蛋白在主根中的丰度,来影响生长素在主根中的运输与分布

研究历史

1913年德国植物学家 G.Haberlandt 从马铃薯韧皮部渗出液中分离物质可诱导马铃薯细胞分裂和愈伤组织的生成。
1940年Folke Skoog从椰奶和酵母抽出液中分离出一些可促进细胞分裂的嘌呤类的化学物质。
1942年,J·van·奥弗贝克等在培养曼陀罗幼胚和未受精的卵细胞的实验中,发现椰子乳明显促进生长,因此设想椰子乳含有能促进细胞分裂的物质。
1948年,Folke Skoog等发现腺嘌呤及其核苷(腺核苷)不仅能诱导组织培养中烟草切段的细胞分裂,而且能促进芽的形成。后来F·Skoog和C·O·Miller发现久放的或经压力锅处理过的DNA中有强烈促进细胞分裂的物质。经过分离和鉴定,证明是6-糠基腺嘌呤,并命名为激动素。激动素(Kinetin)不是天然植物生长调节剂,需人工合成
1963~1964年,D·S·Letham等从幼嫩的玉米种子里分离出一种细胞分裂素。并鉴定了其化学结构,命名为玉米素。后来还发现了一些在结构上与玉米素稍有不同的活性物质,其中之一是在甜玉米中存在的玉米素的核糖衍生物。
1967年Letham证明了椰子乳中主要的活性物质也是玉米素核苷

化学结构

细胞分裂素是腺嘌呤的衍生物。当第6位氨基、第2位碳原子和第9位氨原子上的氢原子被取代时,则形成各种不同的细胞分裂素。活性因侧链的长度、不饱和度和其他性质不同而有很大差异。有些非嘌呤化合物,如N,N′-二苯脲苯并咪唑,也有细胞分裂素活性。
细胞分裂素来源于嘌呤与在N6位置上取代物的结合。N6上取代物异戊间二烯的生物合成前体,与赤霉素脱落酸的一样,都是甲羟戊酸

合成

一般认为,细胞分裂素在根尖、萌发着的种子和发育着的果实、种子处合成,但随着研究的深入,发现茎端也能合成细胞分裂素。细胞分裂素生物合成是在细胞的微粒体中进行的。
1、前体:甲羟戊酸和AMP
2、途径:异戊烯转移酶(isopentenyl transferase,IPT酶)催化下,把二甲烯丙基二磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)的异戊烯基转移到腺苷部分,与植物的ATP、ADP或细菌的AMP分别合成iPTP(异戊烯腺苷-5’-三磷酸)、iPDP(异戊烯腺苷-5’-二磷酸)或iPMP(异戊烯腺苷-5’-一磷酸),它们经过水解酶转变为反式玉米素。

生理作用

细胞分裂素的作用方式还不完-全清楚。已知在tRNA中与反密码子相邻的地方有细胞分裂素,在蛋白质合成过程中,它们参与到tRNA与核糖体mRNA复合体的连接物上。但这可能不是外源细胞分裂素的作用方式。因为在tRNA中,细胞分裂素的合成是由原来在tRNA中的嘌呤的改变产生的。而外源细胞分裂素并不参入tRNA中,但可促进硝酸还原酶、蛋白质和核酸的合成。
细胞分裂素的生理作用主要是引起细胞分裂,诱导芽的形成和促进芽的生长。对组织培养的烟草髓或茎切段,细胞分裂素可使已停止分裂的髓细胞重新分裂。这种现象曾被用于细胞分裂素的生物测定。茎切段的分化常受细胞分裂素及生长素比例的调节。当细胞分裂素对生长素的浓度比值高时,可诱导芽的形成;反之则有促进生根的趋势。如对抑制的腋芽局部施用细胞分裂素,可以解除顶端对腋芽的抑制(即顶端优势)。天然的簇生植物(莲座状植物)或由于病害发生“丛枝病"的植物里,常含有较多的细胞分裂素。细胞分裂素还有防止离体叶片衰老、保绿的作用,这主要是由于细胞分裂素能够延缓叶绿素和蛋白质的降解速度,稳定多聚核糖体(蛋白质高速合成的场所),抑制DNA酶、RNA酶及蛋白酶的活性,保持膜的完整性等。在叶片上局部施用细胞分裂素,能吸聚其他部分的物质向施用处运转和积累,除此之外,细胞分裂素还具有抑制不定根形成和侧根形成,延缓叶片衰老的作用
除了天然的促进细胞分裂的物质外,还用化学方法人工合成了一些类似激动素的物质。通常也统称细胞分裂素。其中活性较强,也常用的是6-苄氨基嘌呤

合成部位:根尖、叶、芽

同位素标记法

同位素标记法,是借助同位素原子以研究有机反应历程的方法。

同位素可用于追踪物质的运行和变化规律。借助同位素原子以研究有机反应历程的方法。即同位素用于追踪物质运行和变化过程时,叫做示踪元素。用示踪元素标记的化合物,其化学性质不变。科学家通过追踪示踪元素标记的化合物,可以弄清化学反应的详细过程。这种科学研究方法叫做同位素标记法。

基本原理

同位素示踪所利用的放射性核素(或稳定性核素)及它们的化合物,与自然界存在的相应普通元素及其化合物之间的化学性质和生物学性质是相同的,只是具有不同的核物理性质。因此,就可以用同位素作为一种标记,制成含有同位素的标记化合物(如标记食物,药物和代谢物质等)代替相应的非标记化合物。利用放射性同位素不断地放出特征射线的核物理性质,就可以用核探测器随时追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变等,稳定性同位素虽然不释放射线,但可以利用它与普通相应同位素的质量之差,通过质谱仪,气相层析仪,核磁共振等质量分析仪器来测定。放射性同位素和稳定性同位素都可作为示踪剂(tracer),但是,稳定性同位素作为示踪剂其灵敏度较低,可获得的种类少,价格较昂贵,其应用范围受到限制;而用放射性同位素作为示踪剂不仅灵敏度,测量方法简便易行,能准确地定量,准确地定位及符合所研究对象的生理条件等特点:

灵敏度高

放射性示踪法可测到 10-14-10-18克水平,即可以从 1015 个非放射性原子中检出一个放射性原子。它比日前较敏感的重量分析天平要敏感 108~107 倍,而迄今最准确的化学分析法很难测定到 10~12 克水平。

方法简便

放射性测定不受其它非放射性物质的干扰,可以省略许多复杂的物质分离步骤,体内示踪时,可以利用某些放射性同位素释放出穿透力强的 r 射线,在体外测量而获得结果,这就大大简化了实验过程,做到非破坏性分析,随着液体闪烁计数的发展,14C 和 3H 等发射软 β 射线的放射性同位素在医学及生物学实验中得到越来越广泛的应用。

定位定量准确

放射性同位素示踪法能准确定量地测定代谢物质的转移和转变,与某些形态学技术相结合(如病理组织切片技术,电子显微镜技术等),可以确定放射性示踪剂组织器官中的定量分布,并且对组织器官的定位准确度可达细胞水平、亚细胞水平乃至分子水平。

符合生理条件

在放射性同位素实验中,所引用的放射性标记化合物的化学量是极微量的,它对体内原有的相应物质的重量改变是微不足道的,体内生理过程仍保持正常的平衡状态,获得的分析结果符合生理条件,更能反映客观存在的事物本质。 放射性同位素示踪法的优点如上所述,但也存在一些缺陷,如从事放射性同位素工作的人员要受一定的专门训练,要具备相应的安全防护措施和条件,在日前个别元素(如氧、氮等)还没有合适的放射性同位素等等。在作示踪实验时,还必须注意到示踪剂同位素效应放射效应问题。所谓同位素效应是指放射性同位素(或是稳定性同位素)与相应的普通元素之间存在着化学性质上的微小差异所引起的个别性质上的明显区别,对于轻元素而言,同位素效应比较严重。因为同位素之间的质量判别是倍增的,如 3H 质量是 1H 的三倍,2H 是 1H 的两倍,当用氚水(3H2O)作示踪剂时,它在普通 H2O 中的含量不能过大,否则会使物理常数、对细胞膜的渗透及细胞质粘性等都会发生改变。但在一般的示踪实验中,由同位素效应引起的误差,常在实验误差内,可忽略不计。放射性同位素释放的射线利于追踪测量,但射线对生物体的作用达到一定剂量时,会改变机体的生理状态,这就是放射性同位素的辐射效应,因此放射性同位素的用量应小于安全剂量,严格控制在生物机体所能允许的范围之内,以免实验对象辐射损伤,而得错误的结果。

应用原理

植物细胞分裂素在植物的生长过程中起着极其重要的作用现将其结构和生理特点介绍如下:
一、细胞分裂素的结构、分布与传导
细胞分裂素是一类具有促进细胞分裂及其他生理功能的物质的总称。最早发现的细胞分裂素类的物质,是从酵母细胞提取液中分离出来的DNA降解物,由于它能促进细胞分裂,因此命名为激动素(简称KT),化学名称为N6-呋喃甲基腺嘌呤,它不是植物内源的生长物质。
二、细胞分裂素的生理作用及其应用
1、细胞分裂素的主要作用是促进细胞分裂。细胞分裂素不仅能促进细胞分裂,也可以使细胞体积扩大。但和生长素不同的是,细胞分裂素是通过细胞横向扩大增粗,而不是促进细胞纵向伸长来增大细胞体积的,它对细胞的伸长有一定的抑制效应
2、延缓植物衰老延缓衰老是细胞分裂素特-有的效应。
3、诱导组织和器官的分化生长素和细胞分裂素共同调控着植物器官的分化。试验证明,细胞分裂素有利于芽的分化,而生长素则促进根的分化,当CTK/IAA的比值较大时,主要诱导芽的形成;当CTK/IAA的比值较小时,则有利于根的形成。
4、消除顶端优势:生长素是导致植物顶端优势的主要原因,而细胞分裂素则能消除顶端优势,促进侧芽的迅速生长。在这方面,生长素同细胞分裂素间表现出明显的对抗作用(两者的产生部位与运转方式决定根系与幼芽的生长、分化)。



稳定同位素标记 细胞分裂素

稳定同位素标记 细胞分裂素



货号英文品名CAS
SCSI-323000[D7]DIHYDROZEATIN-O-GLUCOSIDE (D-DHZOG) [6-[D7](4-hydroxy-3-methylbytylamino)-O-β-D-glucopyranosylpurine]
SCSI-323001[D7]DIHYDROZEATIN-O-GLUCOSIDE RIBOSIDE (D-DZROG) [6-[D7](4-hydroxy-3-methylbutylamino)-9-β-D-ribofuranosyl-O-β-D-glucopyranosylpurine]
SCSI-323002[15N4]meta-TOPOLIN RIBOSIDE (15N-mTR) [6-(3-hydroxybenzylamino)-9-b-D-ribofuranosyl[15N4]purine]2271138-17-9
SCSI-323003[15N4]meta-TOPOLIN-9-GLUCOSIDE (15N-mT9G) [6-(3-hydroxybenzylamino)-9-β-D-glucopyranosylpurine[15N4]purine]
SCSI-323004[15N4]meta-TOPOLIN-7-GLUCOSIDE (15N-mT7G) [6-(3-hydroxybenzylamino)-7-β-D-glucopyranosylpurine[15N4]purine]
SCSI-323005[15N4]ortho-TOPOLIN RIBOSIDE (15N-oTR) [6-(2-hydroxybenzylamino)-9-b-D-ribofuranosyl[15N4]purine]2271138-16-8
SCSI-323006[15N4]ortho-TOPOLIN-9-GLUCOSIDE (15N-oT9G) [6-(2-hydroxybenzylamino)-9-β-D-glucopyranosylpurine[15N4]purine]2271138-03-3
SCSI-323007[15N4]ortho-TOPOLIN-7-GLUCOSIDE (15N-oT7G) [6-(2-hydroxybenzylamino)-7-β-D-glucopyranosylpurine[15N4]purine]
SCSI-323008[15N4]para-TOPOLIN RIBOSIDE (15N-mTR) [6-(4-hydroxybenzylamino)-9-b-D-ribofuranosyl[15N4]purine]2271138-18-0
SCSI-323009[15N4]para-TOPOLIN-9-GLUCOSIDE (15N-pT9G) [6-(4-hydroxybenzylamino)-9-β-D-glucopyranosylpurine[15N4]purine]2271138-05-5
SCSI-323010[15N4]para-TOPOLIN-7-GLUCOSIDE (15N-pT7G) [6-(4-hydroxybenzylamino)-7-β-D-glucopyranosylpurine[15N4]purine]
SCSI-323011[15N4]trans-ZEATIN-9-GLUCOSIDE (15N-tZ9G) [6-((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-9-β-D-glucopyranosyl[15N4]purine]2271138-02-2
SCSI-323012[15N4]cis-ZEATIN RIBOSIDE (cZR) [6-((Z)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-9-b-D-ribofuranosyl[15N4]purine]2271138-15-7
SCSI-323013[15N4]cis-ZEATIN-9-GLUCOSIDE (15N-cZ9G) [6-((Z)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-9-β-D-glucopyranosyl[15N4purine]2271138-01-1
SCSI-323014[15N4]cis-ZEATIN-7-GLUCOSIDE (15N-cZ7G) [6-((Z)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-7-β-D-glucopyranosyl[15N4]purine]2271138-01-1
SCSI-323015[15N5]ADENINE (15N-Ade) [6-amino[15N5]purine]77910-29-3
SCSI-323016[15N5]ADENINE (15N-Ade) [6-amino[15N6]purine]77910-29-3
SCSI-323017[D7]N6-BENZYLADENINE (D-BA) [6-[D7]benzylaminopurine]147028-87-3
SCSI-323018[D7]N6-BENZYLADENOSINE (D-BAR) [6-[D7]benzylamino-9-β-D-ribofuranosylpurine]
SCSI-323019[D7]N6-BENZYLADENINE-9-GLUCOSIDE (D-BA9G) [6-[D7]benzylamino-9-β-D-glucopyranosylpurine]
SCSI-323020[D7]N6 - BENZYLADENOSINE-5'-MONOPHOSPHATE SODIUM SALT (D-BAMP) [6-[D7]benzylamino-9-β-D-ribofuranosylpurine-5'-monophosphate disodium monohydrate]
SCSI-323021[D3]DIHYDROZEATIN (D-DHZ) [6-[D3](4-hydroxy-3-methylbutylamino)purine]175733-30-9
SCSI-323022[15N4]DIHYDROZEATIN (15N-DHZ) [6-[15N4](4-hydroxy-3-methylbutylamino)purine]
SCSI-323023[D3]DIHYDROZEATIN RIBOSIDE (D-DHZR)[6-[D3](4-hydroxy-3-methylbutylamino)-9-β-D-ribofuranosylpurine]175733-31-0
SCSI-323024[D3]DIHYDROZEATIN RIBOSIDE-5'-MONOPHOSPHATE (D-DHZMP) [6-[D3](4-hydroxy-3-methylbutylamino)-9-β-D-ribofuranosyl purine-5'-monophosphate disodium monohydrate]
SCSI-323025[D3]DIHYDROZEATIN-9-GLUCOSIDE (D-DHZ9G)[6-[D3](4-hydroxy-3-methylbutylamino)-9-β-D-glucopyranosylpurine]
SCSI-323026[15N4]HYPOXANTINE (15N-Hyp) [6-[15N4]hydroxypurine]
SCSI-323027[D6]N6-ISOPENTENYLADENINE (D-iP) [6-[D6](3,3-dimethylallylamino)purine]175733-28-5
SCSI-323028[15N4]-ISOPENTENYLADENINE (15N4-iP) [6-[15N4](3,3-dimethylallylamino)purine]
SCSI-323029[D6]N6-ISOPENTENYLADENOSINE (D-iPR) [6-[D6](3,3-dimethylallylamino)-9-β-D-ribofuranosylpurine]175733-29-6
SCSI-323030[15N]N6-ISOPENTENYLADENOSINE (15N-iPR) [6-[15N](3,3-dimethylallylamino)-9-β-D-ribofuranosylpurine]
SCSI-323031[D6]N6-ISOPENTENYLADENOSINE-5'-MONOPHOSPHATE (D-iPMP) [6[D6]-(3,3-dimethylallylamino)-9-β-D-ribofuranosylpurine-5'-monophosphate disodium monohydrate]
SCSI-323032[D6]N6-ISOPENTENYLADENINE-7-GLUCOSIDE(D-iP7G)[6-[D6] (3,3-dimethylallylamino)-7-β-D-glucopyranosylpurine]
SCSI-323033[D6] N6-ISOPENTENYLADENINE-9-GLUCOSIDE (D-iP9G) [6-[D6] (3,3-dimethylallylamino)-9-β-D-glucopyranosylpurine]
SCSI-323034[D6]2-METHYLTHIO-N6-ISOPENTENYLADENINE (D-2MeSiP) [2-methylthio-6-[D6](3,3-dimethylallylamin)purine]1258839-11-0
SCSI-323035[D6]2-METHYLTHIO-N6-ISOPENTENYLADENOSINE (D-2MeSiPR) [2-methylthio-6-[D6](3,3-dimethylallylamino)-9-β-D-ribofuranosylpurine]1258839-12-1
SCSI-323036[15N4]KINETIN(15N-K) [6-furfurylamino[15N4]purine]
SCSI-323037[15N4]meta-METHOXYTOPOLIN (15N-MemT) [6-(3-methoxybenzylamino)[15N4]purine]
SCSI-323038[15N4]meta-TOPOLIN (15N-mT) [6-(3-hydroxybenzylamino)[15N4]purine]2271138-13-5
SCSI-323039[15N4]ortho-TOPOLIN (15N-oT) [6-(2-hydroxybenzylamino)[15N4]purine]2271138-12-4
SCSI-323040[15N4]para-TOPOLIN (15N-pT) [6-(4-hydroxybenzylamino)[15N4]purine]2271138-14-6
SCSI-323041[D5]trans-ZEATIN (D-tZ)[6-[D5]((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)purine]72963-19-0
SCSI-323042[15N]trans-ZEATIN (15N-tZ) [6-((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino) purine]
SCSI-323043[15N4]trans-ZEATIN (15N4-tZ) [6-[15N4]((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino) purine]77900-28-8
SCSI-323044[D5]trans-ZEATIN RIBOSIDE (D-tZR) [6-[D5]((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-9-β-D-ribofuranosylpurine]72963-21-4
SCSI-323045[D5]trans-ZEATIN-7-GLUCOSIDE (D-tZ7G) [6-[D5]((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-7-β-D-glucopyranosylpurine]
SCSI-323046[D5]trans-ZEATIN-9-GLUCOSIDE (D-tZ9G) [6-[D5]((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-9-β-D-glucopyranosylpurine]84744-92-3
SCSI-323047[D5]trans-ZEATIN-O-GLUCOSIDE (D-tZOG) [6-[D5]((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-O-β-D-glucopyranosylpurine]72963-23-6
SCSI-323048[D5]trans-ZEATIN-O-GLUCOSIDE RIBOSIDE (D-tZROG) [6-[D5]((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-9-β-D-ribofuranosyl-O-β-D-glucopyranosylpurine]69700-29-4
SCSI-323049[D5]trans-ZEATIN RIBOSIDE-5'-MONOPHOSPHATE (D-tZMP) [6-[D5]((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-9-β-D-ribofuranosylpurine-5'-monophosphate disodium monohydrate]
SCSI-323050[D5]2-METHYLTHIO-trans-ZEATIN (D-2MetSZ) [2-methylthio-6-[D5]((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)purine]1258839-09-6
SCSI-323051[D5]2-METHYLTHIO-trans-ZEATIN RIBOSIDE (D-2MeStZR) [2-methylthio-6-[D5]((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)-9-β-D-ribofuranosylpurine]1258839-10-9
SCSI-323052[15N4]cis-ZEATIN (15N-cZ) [6-[15N4]((Z)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino) purine]2271138-11-3







































































































































































































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